大豆是世界植物油的主要原料。大豆籽粒中含有20%左右的油脂，其主要成分是脂肪酸，約占總脂肪含量的90%，除脂肪酸外還包含約7%的磷脂和3%的糖脂。大豆脂肪酸主要包含5種組分，即飽和脂肪酸棕櫚酸和硬脂酸，不飽和脂肪酸油酸、亞油酸和亞麻酸，分別約占脂肪酸總量的11.36%、3.30%、54.87%、21.36%和8.96%，達(dá)到了總脂肪酸含量的99.85%。除上述五種脂肪酸組分以外，還有少量的豆蔻酸)、花生酸以及微量的棕櫚油酸、月桂酸和二十二碳酸等脂肪酸成分。大豆油脂中的不飽和脂肪酸有降低患心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的作用，可降低人體中的有害膽固醇，但多不飽和脂肪酸，尤其是亞麻酸，容易被脂肪氧化酶氧化，從而產(chǎn)生豆腥味。改良大豆脂肪酸組分，提高其抗氧化性是近年來大豆脂肪酸育種的主要目標(biāo)。因此，大豆脂肪酸組分的定性定量檢測(cè)技術(shù)成為大豆脂肪酸組分改良研究工作中不可缺少評(píng)價(jià)手段。
大豆脂肪酸組分的檢測(cè)方法主要包括近紅外反射光譜分析法(NIRS)、高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法(GC)，而應(yīng)用最為廣泛的當(dāng)屬氣相色譜法。目前，針對(duì)大豆脂肪酸的檢測(cè)主要以相對(duì)百分比含量測(cè)定為主，無法準(zhǔn)確反映籽粒中脂肪酸組分的絕對(duì)含量，因此亟需建立大豆脂肪酸組分的絕對(duì)定量方法。本研究利用5種大豆脂肪酸甲酯為標(biāo)準(zhǔn)樣品，采用加熱甲酯化提取法和氣相色譜分析方法(GC)相結(jié)合，建立了定性定量鑒定不同大豆脂肪酸組分的絕對(duì)含量的氣相色譜方法，并優(yōu)化了提取和GC檢測(cè)條件，實(shí)現(xiàn)了大豆脂肪酸組分含量檢測(cè)的定量化和計(jì)算方法的標(biāo)準(zhǔn)化，為加速大豆脂肪酸育種和基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支撐。
1、脂肪酸組分的氣相色譜檢測(cè)條件
大豆脂肪酸含量采用泰特GC2030氣相色譜儀進(jìn)行定性定量檢測(cè)。分析檢測(cè)條件為，色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)；自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量：lμL；采用分流進(jìn)樣，分流比：40∶1；進(jìn)樣口溫度：250℃；載氣：氮?dú)猓?4mL·min-1；氫氣，40mL·min-1；空氣，400mL·min-1；采取程序升溫的方式：180℃保持1.5min，以10℃·min-1升到210℃，保持2min，然后以5℃·min-1升到220℃保持5min；檢測(cè)器：火焰離子檢測(cè)器(FID)，溫度為300℃；每個(gè)樣品檢測(cè)20min，樣品檢測(cè)之間間隔2min。
2、脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
準(zhǔn)確稱取棕櫚酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品 20.0mg 放入色譜專用樣品瓶中，加1.0mL正己烷至標(biāo)準(zhǔn)樣品完全溶解。然后從樣品瓶中取500μL溶液放入另一樣品瓶中，加入等體積正己烷，混合均勻，以此類推進(jìn)行半倍稀釋，制作不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，共設(shè)7個(gè)梯度。對(duì)稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行氣相色譜分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其余4種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品的處理方法與棕櫚酸甲酯相同。
3、豆粉脂肪酸提取
簡(jiǎn)易甲酯化提取法(方法一)：準(zhǔn)確稱取大豆粉30.0mg，放入2.0mL的離心管中，加入1.0mL正己烷浸提20min；然后加入1.0mL 0.5mol/L甲醇鈉溶液進(jìn)行甲酯化，充分搖勻10min，使其充分甲酯化，靜置，取上清液放置于色譜專用樣品瓶中，4℃冰箱保存待檢測(cè)。
加熱甲酯化提取法(方法二)：準(zhǔn)確稱取大豆粉30.0mg，放入2.0mL的離心管中，加入1.0mL正己烷，60℃加熱浸提20min，間隔充分搖勻；然后加入1.0mL 0.5mol/L甲醇鈉溶液進(jìn)行甲酯化，充分搖勻10min，使其充分甲酯化；靜置，取上清液放置于色譜專用樣品瓶中，4℃冰箱保存待檢測(cè)。
4、不同檢測(cè)方法的比較
國(guó)內(nèi)外針對(duì)脂肪酸含量的檢測(cè)主要集中于脂肪酸主要組分相對(duì)含量的測(cè)定，而大豆中脂肪酸絕對(duì)含量測(cè)定的研究相對(duì)較少，僅局限于近紅外光譜法。近紅外光譜法雖然方便快捷，無需對(duì)樣品破壞性處理，但它是一種間接的分析技術(shù)，需利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立預(yù)測(cè)模型，然后通過預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)樣品的組分含量。
本文采用五種脂肪酸甲酯作為標(biāo)準(zhǔn)樣品可以準(zhǔn)確地定性不同脂肪酸組分，結(jié)合氣相色譜進(jìn)行脂肪酸檢測(cè)，并制作脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)曲線，其決定系數(shù)(R2)均大于0.99。在定性的基礎(chǔ)上僅通過公式計(jì)算可得大豆樣品各脂肪酸組分絕對(duì)含量，提高了脂肪酸試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。該計(jì)算方法可以利用較少的脂肪酸樣品，定性和定量檢測(cè)不同脂肪酸組分，實(shí)現(xiàn)了脂肪酸含量檢測(cè)計(jì)算方法的標(biāo)準(zhǔn)化，為大豆脂肪酸的深入研究提供了技術(shù)支撐。
為建立大豆脂肪酸組分的絕對(duì)定量方法，采用加熱甲酯化提取法和氣相色譜分析法(GC)，以5種脂肪酸甲酯(棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯)為標(biāo)準(zhǔn)樣品，在制定5種脂肪酸甲酯組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2>0.99)和回歸方程的基礎(chǔ)上，建立了大豆脂肪酸組分的定量測(cè)定方法。該方法可以準(zhǔn)確檢測(cè)大豆籽粒中脂肪酸組分的絕對(duì)含量。通過對(duì)4個(gè)油份含量不同的大豆品種脂肪酸含量測(cè)定以及與粗脂肪含量的比較分析發(fā)現(xiàn)，該方法可顯著提高籽粒中的脂肪酸提取率和檢測(cè)效率，其檢測(cè)的總脂肪酸含量占總油脂含量的94%以上。該方法不僅能檢測(cè)樣品中5種脂肪酸組分的相對(duì)百分比含量，還可以準(zhǔn)確計(jì)算出籽粒中各個(gè)脂肪酸組分的絕對(duì)含量，對(duì)大豆脂肪酸檢測(cè)及育種具有重要意義。
